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抗體定制的效價、特異性等質量指標,通常通過哪些方法驗證?

日期:2025-10-20 15:47:13

    效價和特異性是抗體定制的核心質量指標,其驗證方法需圍繞“量化結合能力”和“排除交叉反應”兩大核心,同時結合抗體的應用場景(如ELISA、WB)選擇針對性方案。

一、效價驗證:量化抗體與抗原的結合能力
    效價反映抗體識別并結合抗原的強度,常用以下3種方法進行定量或半定量評估:
    酶聯免疫吸附試驗(ELISA):將抗原包被在酶標板上,加入梯度稀釋的待檢抗體,通過顯色信號強度計算抗體的效價(如終點稀釋度)。該方法靈敏度高、可量化,是最常用的效價檢測手段,尤其適用于檢測多克隆抗體的整體結合能力。
    免疫印跡(WB):通過SDS-PAGE分離抗原,轉印后用待檢抗體孵育,根據條帶清晰度和可檢測到的最低抗體濃度判斷效價。更適合驗證抗體對變性抗原的結合能力,常用于單克隆抗體或需用于WB實驗的抗體效價評估。
    表面等離子共振(SPR):通過實時監測抗體與芯片表面固定抗原的結合-解離過程,直接計算親和力常數(KD值)。該方法無需標記、可實時定量,能精準反映抗體的親和力(效價的核心指標),但儀器成本較高,適合對抗體質量要求極高的場景(如治療性抗體)。
 

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二、特異性驗證:排除非目標結合與交叉反應
    特異性確保抗體僅識別目標抗原,需通過多維度對照實驗排除干擾,常用方法包括:
    抗原阻斷試驗:在抗體孵育前,加入過量的游離目標抗原與抗體預先結合,再進行ELISA或WB檢測。若目標條帶或顯色信號顯著減弱(通常降低80%以上),說明抗體結合具有抗原特異性,而非非特異性吸附。
    交叉反應檢測:用與目標抗原同源性較高的蛋白(如同家族蛋白、異構體)作為“競爭抗原”,進行ELISA或WB檢測。若抗體僅與目標抗原結合,不與競爭抗原產生信號,說明交叉反應低,特異性強。例如檢測抗人IL-6抗體時,需驗證其是否與IL-1β、IL-8等其他細胞因子交叉結合。
    陰性樣本對照實驗:使用不含目標抗原的樣本(如敲除目標抗原的細胞裂解液、正常組織提取物)作為對照,進行IHC、IF或WB檢測。若陰性樣本無信號或信號極低,可排除抗體對樣本中其他成分的非特異性結合。
    免疫沉淀(IP)結合質譜分析:通過IP實驗用待檢抗體捕獲樣本中的結合蛋白,再通過質譜鑒定捕獲的蛋白成分。若質譜結果僅檢測到目標抗原(及已知的結合蛋白),無其他無關蛋白,可從分子水平證明抗體的特異性。
 
三、其他關鍵質量指標的驗證方法
    除效價和特異性外,抗體的純度、穩定性等指標也需驗證,以確保其符合實驗需求:
    純度驗證:通過SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色,觀察抗體條帶的單一性;或用高效液相色譜(HPLC)分析,純度通常要求≥90%(尤其是單克隆抗體),避免雜蛋白影響實驗結果。
    穩定性驗證:將抗體分別在不同條件下儲存(如4℃、-20℃、室溫),定期(如1周、1個月、3個月)檢測其效價和特異性。若在規定儲存條件下,3-6個月內效價下降不超過20%,說明穩定性合格,可滿足實驗周期需求。