標(biāo)簽內(nèi)參抗體能否用于驗(yàn)證融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況？

日期：2025-10-20 15:50:34

標(biāo)簽內(nèi)參抗體可以用于驗(yàn)證融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況，但需結(jié)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和抗體特性合理使用，同時(shí)要注意其局限性，不能完全替代針對(duì)融合蛋白自身序列的抗體。

一、標(biāo)簽內(nèi)參抗體適用的核心場(chǎng)景

當(dāng)融合蛋白的自身抗體難以獲取（如定制抗體周期長(zhǎng)、成本高），或需快速驗(yàn)證表達(dá)時(shí)，標(biāo)簽內(nèi)參抗體是高效選擇，主要適用于以下場(chǎng)景：

快速初篩表達(dá)與否：若融合蛋白攜帶常見標(biāo)簽（如His、Flag、Myc、HA），可直接使用對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽內(nèi)參抗體，通過WB、IF等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞裂解液或細(xì)胞樣本。只要檢測(cè)到目標(biāo)分子量的條帶或特異性熒光信號(hào)，即可初步證明融合蛋白已在細(xì)胞中表達(dá)。

標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量對(duì)比：在不同實(shí)驗(yàn)條件（如不同轉(zhuǎn)染效率、不同誘導(dǎo)時(shí)間）下，用標(biāo)簽內(nèi)參抗體檢測(cè)融合蛋白，可排除樣本加載量差異的影響，更準(zhǔn)確地對(duì)比融合蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。例如，通過WB實(shí)驗(yàn)中標(biāo)簽抗體條帶的灰度值，量化不同組別的表達(dá)差異。

驗(yàn)證表達(dá)定位：利用熒光標(biāo)記的標(biāo)簽內(nèi)參抗體（如熒光二抗偶聯(lián)的Flag抗體），通過免疫熒光（IF）實(shí)驗(yàn)觀察融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位（如細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜），無需單獨(dú)制備針對(duì)融合蛋白自身的熒光抗體。

二、使用時(shí)必須注意的局限性

標(biāo)簽內(nèi)參抗體雖便捷，但無法完全反映融合蛋白的真實(shí)狀態(tài)，需通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)規(guī)避以下問題：

無法排除標(biāo)簽游離或蛋白降解：若融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生部分降解，可能僅殘留帶有標(biāo)簽的片段，此時(shí)標(biāo)簽內(nèi)參抗體會(huì)檢測(cè)到信號(hào)，但實(shí)際完整的融合蛋白已不存在。需結(jié)合融合蛋白的預(yù)期分子量（通過WB條帶大小）判斷，或搭配針對(duì)融合蛋白另一端序列的抗體（若有）交叉驗(yàn)證。

不能區(qū)分融合蛋白與其他帶相同標(biāo)簽的蛋白：若細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)其他攜帶相同標(biāo)簽的外源蛋白（如共轉(zhuǎn)染的其他標(biāo)簽載體），或細(xì)胞自身存在與標(biāo)簽非特異性結(jié)合的成分，標(biāo)簽內(nèi)參抗體會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。需設(shè)置空白對(duì)照（未轉(zhuǎn)染融合蛋白的細(xì)胞）和陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染空標(biāo)簽載體的細(xì)胞），排除非特異性信號(hào)干擾。

無法驗(yàn)證融合蛋白的功能性：標(biāo)簽內(nèi)參抗體僅能證明“蛋白存在”，但不能驗(yàn)證融合蛋白是否正確折疊、是否形成預(yù)期構(gòu)象，或是否具有生物學(xué)活性（如酶活性、結(jié)合能力）。若需驗(yàn)證功能，還需結(jié)合功能性實(shí)驗(yàn)（如酶活測(cè)定、IP檢測(cè)互作蛋白）。

三、關(guān)鍵使用建議

為確保結(jié)果可靠，使用標(biāo)簽內(nèi)參抗體驗(yàn)證融合蛋白表達(dá)時(shí)，需遵循以下3點(diǎn)建議：

嚴(yán)格設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)：必須包含3類對(duì)照——空白對(duì)照（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染空標(biāo)簽載體細(xì)胞）、陽(yáng)性對(duì)照（轉(zhuǎn)染已知可表達(dá)的標(biāo)簽融合蛋白細(xì)胞），通過對(duì)照排除非特異性結(jié)合和實(shí)驗(yàn)體系誤差。

結(jié)合分子量判斷完整性：在WB實(shí)驗(yàn)中，需根據(jù)融合蛋白的理論分子量（標(biāo)簽分子量+目標(biāo)蛋白分子量）判斷條帶位置。若檢測(cè)到的條帶遠(yuǎn)小于理論分子量，需警惕蛋白降解，此時(shí)標(biāo)簽信號(hào)不能代表完整融合蛋白的表達(dá)。

優(yōu)先選擇高特異性標(biāo)簽抗體：不同標(biāo)簽抗體的特異性差異較大，例如His抗體易與細(xì)胞內(nèi)組氨酸含量高的蛋白非特異性結(jié)合，而Flag、Myc抗體的特異性通常更高。建議選擇經(jīng)過驗(yàn)證、適用于細(xì)胞樣本的標(biāo)簽內(nèi)參抗體，減少假陽(yáng)性。