抗體定制的核心流程通常包含哪些關(guān)鍵步驟？
日期：2025-10-22 13:55:02
抗體定制的核心流程主要包含抗原制備、免疫動物/細(xì)胞、抗體篩選、純化鑒定、規(guī)模化生產(chǎn)五大關(guān)鍵步驟，整個流程需根據(jù)定制類型（多克隆/單克隆）和應(yīng)用場景調(diào)整細(xì)節(jié)。
1、需求確認(rèn)與方案設(shè)計：明確定制目標(biāo)
這是流程的起點(diǎn)，直接決定后續(xù)所有步驟的方向。
明確核心需求：確定定制抗體的類型（多克隆抗體/單克隆抗體）、目標(biāo)抗原（蛋白、多肽、小分子等）、應(yīng)用場景（ELISA、WB、IHC等）及交付標(biāo)準(zhǔn)（效價、純度、產(chǎn)量）。
評估可行性：分析抗原的免疫原性，若抗原免疫原性弱（如小分子、短肽），需提前設(shè)計偶聯(lián)方案（如與BSA、KLH等載體蛋白偶聯(lián)）以增強(qiáng)免疫效果。
制定詳細(xì)方案：確定免疫動物種類（如兔、小鼠、山羊）、免疫周期、檢測方法及交付時間節(jié)點(diǎn)。
2、抗原制備：提供免疫基礎(chǔ)
高質(zhì)量抗原是獲得高特異性、高效價抗體的前提。
抗原獲取：根據(jù)需求選擇合適的制備方式，包括重組蛋白表達(dá)純化（如原核/真核表達(dá)系統(tǒng)）、天然蛋白提取、化學(xué)合成多肽等。
抗原純化與鑒定：通過層析（如Ni柱、GST柱）、電泳等方法純化抗原，使用SDS-PAGE、HPLC等檢測抗原純度（通常要求純度≥90%），確保無雜蛋白干擾免疫反應(yīng)。
抗原處理（按需）：對小分子或短肽抗原進(jìn)行載體偶聯(lián)，對易降解抗原添加保護(hù)劑，保證抗原在免疫過程中保持活性。
3、免疫與抗體生成：誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生目標(biāo)抗體
通過多次免疫動物或培養(yǎng)免疫細(xì)胞，激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對目標(biāo)抗原的特異性抗體。
（1）多克隆抗體制備路徑
動物免疫：按照預(yù)設(shè)方案，將抗原與佐劑（如弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑）混合后，通過皮下注射、腹腔注射等方式免疫動物。
加強(qiáng)免疫：首次免疫后，間隔2-4周進(jìn)行2-3次加強(qiáng)免疫，逐步提高動物體內(nèi)抗體效價。
血清收集：末次免疫后1-2周，通過心臟采血或耳緣靜脈采血獲取抗血清，離心分離血清備用。
（2）單克隆抗體制備路徑
動物免疫：流程與多克隆抗體類似，需確保免疫后小鼠脾臟中產(chǎn)生足量的特異性B淋巴細(xì)胞。
細(xì)胞融合：取免疫小鼠的脾臟細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞（如SP2/0細(xì)胞）在PEG（聚乙二醇）或電融合技術(shù)作用下融合，形成雜交瘤細(xì)胞。
雜交瘤篩選與克隆化：使用HAT培養(yǎng)基篩選出存活的雜交瘤細(xì)胞，通過有限稀釋法或單細(xì)胞克隆技術(shù)，篩選并克隆能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
4、抗體篩選與鑒定：確保抗體質(zhì)量
通過一系列檢測，篩選出符合需求的抗體，并驗(yàn)證其關(guān)鍵性能指標(biāo)。
效價檢測：采用ELISA法檢測抗血清或雜交瘤細(xì)胞上清液的抗體效價，確保抗體濃度達(dá)到預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)（如多克隆抗體效價≥1:10000）。
特異性鑒定：使用WB（蛋白免疫印跡）、IHC（免疫組化）、FlowCytometry（流式細(xì)胞術(shù)）等方法，驗(yàn)證抗體是否能特異性結(jié)合目標(biāo)抗原，排除交叉反應(yīng)。
親和力檢測：通過SPR（表面等離子體共振）或ELISA競爭法，測定抗體與抗原的親和力，確保滿足后續(xù)應(yīng)用對親和力的要求。
5、抗體純化與規(guī)模化生產(chǎn)：獲取最終產(chǎn)品
對篩選合格的抗體進(jìn)行純化，并根據(jù)需求擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。
抗體純化：根據(jù)抗體類型選擇合適的純化方法，多克隆抗體常用ProteinA/G層析、抗原親和層析；單克隆抗體可通過雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)（腹水培養(yǎng)或無血清懸浮培養(yǎng)）后，再進(jìn)行層析純化，最終獲得高純度抗體（通常純度≥95%）。
規(guī)模化生產(chǎn)：若需大量抗體，多克隆抗體可通過加大免疫動物數(shù)量、多次采血實(shí)現(xiàn)；單克隆抗體可通過生物反應(yīng)器擴(kuò)大雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模，或采用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組抗體生產(chǎn)。
質(zhì)量質(zhì)控與分裝：對純化后的抗體進(jìn)行純度、內(nèi)毒素、穩(wěn)定性檢測，合格后分裝成不同規(guī)格（如100μL、1mL），并根據(jù)儲存要求（如-20℃、4℃）添加保護(hù)劑，完成最終交付。
