ELISA試劑盒中的洗滌緩沖液的主要成分是什么?
日期:2025-08-28 14:57:31
在ELISA實驗中,洗滌緩沖液(Wash Buffer)的核心功能是去除未結合的游離試劑(如未結合的抗體、酶標記物、封閉液殘留等),減少非特異性吸附帶來的背景干擾,同時維持反應體系的 pH 穩定,保障后續實驗步驟的特異性。其成分設計需平衡 “洗滌效率” 與 “對固相結合物的保護”,核心成分可分為4類,具體如下:
一、洗滌緩沖液的核心成分及作用
ELISA洗滌緩沖液多以 “緩沖鹽溶液為基礎,添加表面活性劑增強洗滌效果,部分含防腐劑延長保質期”,各類成分的功能及常用規格如下:
成分類別 | 常用物質 | 核心作用 | 典型濃度 / 規格 |
1. 緩沖鹽(基礎骨架) | 磷酸二氫鈉(NaH?PO?)、磷酸氫二鈉(Na?HPO?) | 維持洗滌液的 pH 穩定(通常 pH 7.2-7.4,接近生理環境),避免 pH 波動破壞抗原 - 抗體的特異性結合,同時保護酶(如 HRP)的活性。 | 組成PBS(磷酸鹽緩沖液):0.01 mol/L(即 10 mM),其中 NaH?PO?與 Na?HPO?按比例混合(如 pH 7.4 時,二者濃度約為 1.8 mM 和 8.2 mM)。 |
Tris(三羥甲基氨基甲烷)、鹽酸(HCl) | 組成Tris-HCl 緩沖液,pH 緩沖范圍更廣(7.0-9.0),部分情況下(如 AP 酶標記體系)比 PBS 更適合維持酶活性。 | 0.05 mol/L Tris-HCl(即 50 mM),用 HCl 調節 pH 至 7.4-8.0。 | |
2. 表面活性劑(關鍵洗滌成分) | Tween-20(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯) | 降低液體表面張力,增強洗滌液對酶標板孔壁的浸潤性,有效剝離孔壁上 “非特異性吸附的抗體 / 酶標記物”,同時不破壞已結合的 “抗原 - 抗體復合物”,是ELISA洗滌液中最常用的表面活性劑。 | 終濃度通常為0.05%(V/V)(即 1000 mL 緩沖鹽中加入0.5mL Tween-20),濃度過高可能導致特異性結合物脫落,過低則洗滌不充分。 |
Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) | 去污能力強于Tween-20,但對蛋白質(如抗體、酶)的變性風險略高,僅在 “非特異性吸附嚴重” 的特殊場景(如檢測疏水性抗原)中偶爾使用。 | 終濃度通常為0.01%-0.1%(V/V),需謹慎控制濃度。 | |
3. 防腐劑(延長保質期) | 疊氮鈉(NaN?) | 抑制細菌、真菌生長,延長洗滌液(尤其是配好的工作液)的儲存時間,常用于商品化試劑盒的濃縮洗滌液中。 | 終濃度0.02%(W/V)(即0.2g/L),需注意:疊氮鈉對 HRP(辣根過氧化物酶)有輕微抑制作用,若體系為 HRP 標記,需確保洗滌充分,避免殘留。 |
硫柳汞(Thiomersal) | 廣譜防腐劑,對酶活性影響更小,適合對疊氮鈉敏感的檢測體系(如部分 AP 酶標記體系)。 | 終濃度 0.01%(W/V),但因潛在毒性,目前使用頻率低于疊氮鈉。 | |
慶大霉素(Gentamicin) | 抗生素類防腐劑,無毒性,對酶和抗體無影響,適合要求較高的 “無毒性實驗體系”(如細胞相關 ELISA)。 | 終濃度50-100μg/mL,成本較高,多在定制化試劑盒中使用。 | |
4. 鹽類(調節離子強度) | 氯化鈉(NaCl) | 維持洗滌液的離子強度(通常 0.137mol/L,即生理鹽水水平),減少 “因離子強度過低導致的非特異性結合”,同時避免高鹽對蛋白質結構的破壞。 | 與PBS或Tris-HCl配套使用,如PBS中NaCl濃度通常為137mM。 |

二、常見洗滌緩沖液配方示例
ELISA中最常用的洗滌緩沖液為 “含 Tween-20 的 PBS”(即 PBST),其經典配方(1× 工作液)如下:
磷酸二氫鈉(NaH?PO??2H?O):0.27g
磷酸氫二鈉(Na?HPO??12H?O):2.9g
氯化鈉(NaCl):8.0g
Tween-20:0.5 mL
超純水:加至 1000 mL
調節pH至7.2-7.4,可根據需求添加0.02% 疊氮鈉作為防腐劑。
三、使用注意事項
濃縮液需稀釋:商品化試劑盒中的洗滌液多為 10× 或 20× 濃縮液,使用前需用超純水或去離子水精確稀釋至 1× 工作液,稀釋不足會導致離子強度過高(可能破壞抗原 - 抗體結合),稀釋過度則洗滌效果下降;
室溫平衡:從冰箱取出的洗滌液需平衡至室溫(20-25℃)后使用,避免低溫導致酶標板孔壁產生冷凝水,影響洗滌均勻性;
洗滌方式與次數:常規 ELISA 需洗滌 3-5 次,每次加入洗滌液后需靜置30-60秒(即 “浸泡洗滌”),最后一次洗滌后需將酶標板倒扣在吸水紙上拍干(避免殘留洗滌液影響顯色);若為自動洗板機,需設置合適的 “加液量”(如每孔300μL)和 “抽吸次數”,確??變葻o殘留液體;
避免反復凍融:濃縮洗滌液建議分裝后儲存,避免反復凍融導致防腐劑失效或成分沉淀;配好的 1× 工作液(含防腐劑)可在 4℃儲存 1-2 周,無防腐劑則需現配現用。
ELISA洗滌緩沖液的成分設計圍繞 “高效去游離、穩定反應環境、延長保質期” 展開,其中PBST(含0.05%Tween-20的0.01M PBS) 是最通用的選擇,具體使用需嚴格參照試劑盒說明書(部分特殊檢測體系可能需要定制化洗滌液,如不含Tween-20的緩沖液)。