洗滌步驟在ELISA檢測中起到什么作用，常見的洗滌液成分有哪些，洗滌次數該如何把控？

日期：2025-09-16 14:39:55

在ELISA檢測中，洗滌步驟是消除非特異性結合、降低背景信號、確保結果特異性和準確性的 “關鍵質控環節”，其核心目標是移除未結合的干擾物質，僅保留特異性結合的抗原-抗體-酶復合物。以下從作用、成分、洗滌次數三方面展開解析：

一、洗滌步驟的核心作用：排除干擾，純化特異性結合信號

ELISA的反應體系（如包被板孔內）存在大量 “非特異性結合物質”（如未結合的抗體、游離酶標物、樣本中的雜蛋白等），這些物質若不清除，會與底物反應產生 “假陽性信號” 或拉高背景值，導致結果誤判。洗滌步驟的本質是通過物理沖洗，選擇性保留特異性結合的復合物（如包被抗體 - 抗原 - 酶標抗體復合物），移除所有游離干擾物，具體作用可分為 3 點：

1、移除未結合的抗體/酶標物，避免假陽性

例如：在 “雙抗體夾心法” 中，加入酶標抗體后，部分酶標抗體會因 “疏水作用” 或 “非特異性吸附” 黏附在板孔壁上（未與抗原結合）。若不洗滌，這些游離的酶標抗體會與后續加入的底物反應，產生 “無特異性的顏色信號”，導致原本陰性的樣本被誤判為陽性（假陽性）。

2、降低背景信號，提升檢測靈敏度

樣本中的雜蛋白（如血清中的白蛋白、球蛋白）、試劑中的微量雜質也會非特異性吸附在板孔表面，這些物質雖不直接與酶反應，但會增加 “背景吸光度”（即空白孔或陰性對照孔的信號值）。洗滌可移除這些雜蛋白，使背景信號降至最低，從而更清晰地區分 “陽性信號” 與 “背景信號”，提升對低濃度目標抗原的檢測靈敏度。

3、終止前一步反應，避免交叉干擾

部分 ELISA 步驟（如封閉、一抗孵育）后，殘留的試劑（如封閉液中的BSA、未結合的一抗）可能與后續試劑（如二抗、酶標物）發生非特異性反應。洗滌可徹底移除前一步的殘留試劑，確保后續反應僅在 “特異性結合復合物” 的基礎上進行，避免步驟間的交叉干擾。

二、常見洗滌液的成分：以 “緩沖液+表面活性劑” 為核心

ELISA洗滌液的設計需滿足兩個核心需求：保持特異性結合復合物的穩定（不破壞抗原-抗體結合）、高效移除游離物質。因此，其成分通常以 “中性緩沖液” 為基礎，添加 “表面活性劑” 增強洗滌效果，常見配方如下：

成分類別	核心作用	常見物質及說明
基礎緩沖液	維持反應體系pH穩定，避免抗原抗體解離	PBS（磷酸緩沖鹽溶液）：最常用，pH 7.2-7.4，滲透壓與生理環境接近，能穩定抗原抗體結合； Tris-HCl緩沖液：pH 7.4-8.0，適用于對 pH 更敏感的抗體體系，穩定性略高于 PBS；注意：緩沖液需不含金屬離子（如Zn²?、Cu²?），避免抑制酶活性（如 HRP 酶對金屬離子敏感）。
表面活性劑	降低表面張力，增強對非特異性吸附物的洗脫	Tween-20：最常用，濃度0.05%-0.1%，溫和且不破壞抗原抗體結合，能有效洗脫板孔壁上的非特異性吸附蛋白； Tween-80：與Tween-20作用類似，但親水性稍弱，多用于脂肪含量較高的樣本（如血漿）洗滌；注意：表面活性劑濃度不可過高（>0.5%），否則會破壞特異性結合，導致信號降低。
防腐劑（可選）	防止洗滌液在儲存過程中滋生細菌、霉菌	疊氮鈉（NaN?）：濃度0.02%-0.05%，抑菌效果強，但嚴禁用于 HRP 酶體系（疊氮鈉會強烈抑制HRP活性）；硫柳汞：濃度0.01%，適用于HRP、AP（堿性磷酸酶）體系，兼容性更廣；商用洗滌液多已添加防腐劑，自配時需根據酶種類選擇。