ELISA試劑盒的酶標抗體一般選用什么酶進行標記？
日期：2025-08-27 13:44:21
ELISA試劑盒中，酶標抗體（即與酶偶聯的抗體）的核心功能是通過酶催化底物反應產生可檢測信號（如顏色、熒光），從而間接定量目標抗原/抗體。辣根過氧化物酶（HRP） 和堿性磷酸酶（AP） 是目前應用最廣泛的兩種標記酶，此外還有 β- 半乳糖苷酶（β-Gal）等小眾類型，不同酶的特性決定了其適用場景。
一、主流標記酶的特性與適用場景
一、主流標記酶的特性與適用場景
1. 辣根過氧化物酶（HRP）：最常用的 “性價比之選”
HRP是從辣根中提取的含血紅素輔基的酶，因分子量小（約44kDa）、催化效率高、穩定性強、成本低等優勢，占據ELISA標記酶的主導地位，尤其適合常規顯色型檢測。
HRP是從辣根中提取的含血紅素輔基的酶，因分子量小（約44kDa）、催化效率高、穩定性強、成本低等優勢，占據ELISA標記酶的主導地位，尤其適合常規顯色型檢測。
催化機制：以過氧化氫（H?O?）為氧化劑，催化底物（如TMB、OPD、ABTS）發生氧化還原反應，生成有色產物（TMB氧化后呈藍色，終止后變黃色；OPD氧化后呈橙黃色）。
關鍵優勢：
分子量小，單個抗體可偶聯多個HRP分子（不影響抗體結合活性），信號放大效果好；
對pH（最適 pH 5.0-6.0）和溫度適應性較強，室溫下可穩定保存（偶聯后抗體-酶復合物穩定性高）；
底物種類豐富且成熟，TMB因靈敏度高、無致癌性，是目前最主流的HRP底物。
適用場景：絕大多數常規ELISA檢測（如雙抗體夾心法、間接法），尤其適合對成本和檢測速度有要求的實驗（底物反應快，通常15-30分鐘即可顯色）。
2. 堿性磷酸酶（AP）：高靈敏度的 “特殊需求之選”
AP是一類催化磷酸酯水解的酶，常見來源為牛小腸黏膜（CIP，堿性磷酸酶）或大腸桿菌（rAP），因催化效率高、背景信號低、可適配化學發光底物，適合高靈敏度檢測或樣本中含 HRP 抑制劑（如血紅蛋白、還原劑）的場景。
催化機制：水解底物分子上的磷酸基團，常見底物包括：
顯色底物：pNPP（對硝基苯磷酸酯），水解后生成黃色的對硝基苯酚，適合常規檢測；
化學發光底物：AMPPD（3-(2'- 螺旋金剛烷)-4 - 甲氧基 - 4-(3'- 磷酰氧基) 苯-1,2-二氧雜環丁烷），水解后釋放持續的化學發光信號，靈敏度比 HRP-顯色體系高1-2 個數量級。
關鍵優勢：
無內源性干擾：樣本（如血清、細胞裂解液）中內源性HRP較多（如紅細胞含HRP類似活性物質），但內源性AP含量極低，背景信號更穩定；
化學發光適配性：搭配AMPPD等底物時，信號持續時間長（可達數小時），適合弱信號檢測（如低濃度細胞因子、微量抗體）。
適用場景：
高靈敏度需求實驗（如檢測pg級別的目標分子）；
樣本中含HRP抑制劑的場景（如全血樣本、含還原劑的裂解液）；
化學發光ELISA（比顯色法更靈敏，適合批量樣本高通量檢測）。
3. 其他小眾標記酶（β- 半乳糖苷酶，β-Gal）
β-Gal是從大腸桿菌或酵母菌中提取的酶，分子量較大（約116kDa），因底物特異性強、可適配熒光 / 顯色底物，主要用于特殊場景（如原位ELISA、細胞內抗原檢測），但應用遠少于HRP和AP。
催化機制：水解β-半乳糖苷類底物，如熒光底物4-MUG（4-甲基傘形酮 -β-D-半乳糖苷），水解后釋放藍色熒光（激發波長360nm，發射波長460nm）；顯色底物ONPG（鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷），水解后生成黃色的鄰硝基苯酚。
局限性：分子量過大，偶聯到抗體后可能影響抗體與抗原的結合活性；且酶活性對溫度和pH敏感（最適pH7.0-7.5），穩定性較差，成本較高，因此僅在特定熒光檢測場景中使用。
二、酶的選擇與試劑盒性能的關聯
不同品牌ELISA試劑盒選擇標記酶時，會結合檢測目標的濃度、樣本類型、檢測方法（顯色/發光） 綜合考量：
若檢測常規濃度目標（如μg/mL級別），優先選HRP（成本低、操作便捷）；
若檢測低濃度目標（如pg/mL級別）或樣本背景高，優先選AP-化學發光體系（靈敏度高、干擾少）；
若需熒光檢測（如原位ELISA觀察細胞內抗原分布），則可能選用β-Gal。
此外，酶與抗體的偶聯效率（如每分子抗體偶聯的酶數量）也會影響檢測性能 —— 優質試劑盒會通過優化偶聯工藝（如戊二醛法、馬來酰亞胺法），確保酶活性和抗體結合活性均不受損，避免因偶聯效率低導致信號減弱或背景升高。
ELISA試劑盒的酶標抗體以HRP和AP為主，兩者各有優勢：HRP適合常規、低成本、快速顯色檢測；AP適合高靈敏度、低背景或化學發光檢測，實際選擇需匹配實驗需求和樣本特性。
